هيدروكسي آپاتيت در مهندسي بافت استخوان

بهترين گزينه براي اعمال جراحي ارتوپدي، استفاده از پيوند استخوان ‏autologous‏ براي تحريك استخوان سازي و تثبيت ايمپلنت مي باشد؛ در حاليكه تعداد محدودي استخوان براي ‏autograft‏ (بافت خود فرد) موجود است و احتمال ايجاد مشكلات زيادي در محل دهنده وجود دارد.  ‏Allografts‏ ( بافت فرد ديگر) از بانك استخوان در حال حاضر راه كار ديگري است ، اما احتمال بالاي عواقبي چون بيماري ‏graft-versus-host‏ و انتقال بيماري هاي عفوني و در نتيجه پس زدن بافت وجود دارد. بنابراين استفاده از يك روش جايگزين مورد تحقيق قرار گرفته است. كشت سلول هاي استخوان زا روي داربست متخلخل مي تواند يك راه حل جديد براي پيوند استخوان  با استفاده از سلول هاي مزانشيمي خود شخص باشد.‏


ساختار استخوان

اولين قدم در مهندسي بافت استخوان و غضروف ، بررسي ساختار و عملكرد اين سلول ها است‎.‎‏ استخوان از يك قالب  يا ماتريس آلي محكم تشكيل شده كه به وسيلة رسوب املاح كلسيم تقويت مي شود. املاح متبلوري كه در ماتريس آلي استخوان رسوب مي كند، اصولا از كلسيم و فسفات تشكيل شده، كه هيدروكسي آپاتيت ناميده مي شود. هر بلور كريستال حدود 400 آنگستروم طول، 10 تا 30 آنگستروم ضخامت و 100 آنگستروم پهنا دارد و به شكل يك صفحه مسطح بلند است. ‏
هر فيبر كلاژن از قطعات تكرار شونده به فاصلة هر640  آنگستروم در طولش تشكيل شده است. بلورهاي هيدروكسي آپاتيت در مجاورت هر قطعه از فيبر قرار گرفته و محكم به آن مي‌چسبد، (شكل 1). اين اتصال نزديك از لغزيدن كريستالها و فيبرهاي كلاژن بر روي يكديگر و خارج  شدن از محل خود جلوگيري مي كند  و براي تأمين  استحكام استخوان ضروري است. ‏

هيدروكسي آپاتيت
هيدروكسي آپاتيت1 يك ماده معدني و از اشكال طبيعي كلسيم آپاتيت است و بطور طبيعي در استخوان ، دندان و مرجان هاي دريايي يافت مي‌شود. در بين خواص و ويژگي هاي هيدروكسي آپاتيت به عنوان يك بيومتريال ، مهمترين ويژگي را مي توان‎ ‎زيست سازگاري2 عالي آن دانست.‏‎ ‎در واقع هيدروكسي آپاتيت، زيست فعال است. زيست فعال بودن يك ماده توانايي آن ماده را براي اتصال به بافت زنده بدون ايجاد لايه كلاژني بيان مي كند. علاوه بر زيست سازگاري عالي ، به نظر مي رسد كه هيدروكسي آپاتيت پيوند شيميايي مستقيمي با بافت هاي سخت برقرار مي كند.
مهندسي بافت استخوان
مهندسي بافت علم طراحي و توليد بافت هاي جديد براي ترميم اندام هاي آسيب ديده و جايگزين قسمت هاي از دست رفته به علت عوامل مختلف است. در بين بافت هاي بدن ، استخوان پتانسيل بالايي براي توليد مجدد دارد و از اين رو يك نمونه مناسب براي مهندسي بافت به شمار مي رود. در شكستگي ها و عيوب بزرگ ، روند درمان كه توسط بدن انجام مي شود، كارساز نبوده و پيوند استخوان لازم مي شود. فاكتور هاي مؤثر در پيوند استخوان در شكل (2) نشان داده شده است. اولين گزينه استفاده از استخوان خود فرد (‏autograft‏) است، كه معمولا از استخوان لگن خاصره3 گرفته شده به محل مورد نظر پيوند زده مي شود. مقدار تقاضا براي پيوند از خود فرد يعني از منبع موجود تامين مي شود چون تنها برداشت نمونه هاي كوچك از بيمار امكان پذير است. يكي ديگر از مشكلات احساس درد و رنج بيمار در محل دهنده4 ، پس از عمل جراحي است. در ‏autograft‏ مدت زمان جراحي و در نتيجه هزينه ها و ريسك براي بيمار افزايش مي يابد.از ‏allograft‏ ( كه استخوان انسان ديگر پيوند زده مي شود) امروزه اغلب در جراحي هاي مفاصل پروستتيك استفاده مي شود. پيوند ‏Xenograft‏ اكثرا آپاتيت گاوي يا خوكي و مرجان هاي دريايي است. اين بافت ها مشكلاتي از قبيل كم دوامي ، استحكام مكانيكي غير قابل پيش بيني و ريسك انتقال بيماري را دارد.موفقيت هر پيوند استخوان مستلزم داشتن تعداد سلول استخوان زا كافي در محل است. يك پيوند استخوان ايده آل بايد بتواند يك قالب استخواني براي تجمع و رسوب استخوان ايجاد كند. فاكتورهاي رشد ‏osteoinductive‏ ، كه در استخوان طبيعي انسان وجود دارد، با تحريك سلول هاي بنيادي يا سلول هاي استخواني نابالغ به رشد و بالغ شدن ، استخوان را شكل مي دهد.‏
كشت سلول هاي استخوان زا5 روي داربست متخلخل مي تواند يك راه حل جديد براي پيوند استخوان  با استفاده از سلول هاي مزانشيمي خود شخص باشد. سلول هاي مزانشيمي را به روش استاتيك و در ‏spinner flasks‏ براي 1 ، 7 ، 14 و 21 روز كشت داده و قابليت تمايز ، تكثير و توزيع سلول ها را در واحد حجم داربست آنها بررسي و مقايسه خواهيم كرد. نرخ سرعت‎ ‎تمايز سلول هاي ‏‎ osteogenic‎‏ با  با سنجش فعاليت آلكالين فسفات6 و زنجيره پليمري ‏‎ real-time reverse transcriptase‎‏ براي 10 سلول ‏osteogenic‏ نشان دار شده ، مشخص مي شود. سرعت رشد سلول ها و تعداد سلول ها در داربست توسط مقدار ‏DNA‏ در تصويرهاي ‏SEM‏ و ميكروسكوپ  فلوئورسانس مشخص مي شود. ‏

رشد و تمايز سلول هاي مزانشيمي روي داربست هيدروكسي آپاتيت‏
در مهندسي بافت استخوان، يك استراژي كشت سلول هاي ‏osteogenic  ‎‏  روي داربست متخلخل است. هدف ارائه يك راه حل جديد براي پيوند استخوان با استفاده از سلول هاي مزانشيمي خود فرد است. سلول هاي مزانشيمي انسان را مي توان از مغز استخوان براي افزايش و گسترش و تمايز  در استئوبلاست7 ها در محيط ‏in vitro‏ استخراج  كرد، كه يك منبع سلول قابل توجهي است. تمايز سلول هاي مزانشيمي انسان‌‌ با مجموعه پيچيده اي از هورمون ها و فاكتورهاي ‏transcription‏ كه از ميان آنها ‏Cbfa1 ‎‏  و ‏osterix‏ مهم تر است، كنترل مي شود.
كشت سلول هاي مزانشيمي انسان روي داربست هاي ‏‎3D‎‏ به دليل ضعف توزيع غذا و اكسيژن رساني  به بخش مركزي داربست و حتي پخش و توزيع سلول ها ،آسان نيست. اين مشكل سايز‌‏‎ ‎داربست را در روش كشت استاتيك محدود مي‌كند، زيرا سلول ها تنها مي توانند حدود‌اً در عمق ‏m ‎‏µ 250  رشد كنند. روش هاي كشت ديناميك مختلفي مورد بررسي قرار گرفته شده تا بر مشكل نفوذ غلبه شود: كشت روي ‏orbital shaker ‎، ‏rotating wall vessel bioreactors ‎، ‏spinner flasks ‎و ‏bioreactors ‎‏  . در تحقيقات مختلفي نشان داده شد كه اين روش ها اثر مثبتي بر تكثير و‎ ‎تمايز سلول ها دارد.
مطالعات زيادي بيومتريال هاي متخلخل ‏‎3D‎‏ با ويژگي هاي ساختاري و شيميايي مختلف را براي  ترميم بافت استخوان مورد بررسي قرار داده. هيدروكسي آپاتيت از جمله موادي است كه ويژگي هاي مناسبي دارد و در فرم هاي مختلف، مورد تاييد ‏FDA‏ قرار گرفته است و در حال حاضر به عنوان پركننده استخوان كاربرد كلينيكي دارد. پارامترهاي مهم داربست تخلخل و اندازه سوراخ مناسب است. طراحي داربست هايي كه براي پيوند استخوان به كار مي‌رود، تقليدي از ساختار ميله ميله استخوان با سايز تخلخل هاي 200 و 900 ميكرومتر است. اندازه تخلخل براي غذا رساني سلول ها چسبندگي سلول ها ، رشد و در نتيجه تمايز داراي اهميت است.‏‎ ‎
هدف بررسي اثر كشت ديناميك و اندازه تخلخل هاي داربست روي سلول هاي بنيادي مغز استخوان انسان است. در اينجا از ‏hMSC- telomerase reverse transcriptase(TERT)‎‏ كه فنا ناپذيري و امكان تمايز دارد استفاده مي شود. از داربست هايي با تخلخل 200 و 500 ميكرومتر استفاده مي شود. سلول هاي مزانشيمي روي داربست ها به دو روش استاتيك و ديناميك كشت داده شده و توزيع و پخش ، تكثير و تمايز سلول ها بررسي مي شود.

 داربست
داربست از يك ‏core‏ از كلسيم كربنات با لايه اي نازك از هيدروكسي آپاتيت در لايه خارجي تر تشكيل شده است. قطر داربست ‏‎10mm‎‏ ، ارتفاع آن ‏‎2mm‎‏ و با يك ‏hole‏ مركزي ‏‎1.5mm‎‏ است. دو نوع داربست با تخلخل هاي ميانگين 200 و 500 ميكرومتر استفاده شده است. ‌تصاوير ‏CT‏µ و ‏SEM‏ داربست را در شكل 4 نشان داده شده است. رزولوشن تصاوير ‏CT‏µ با  40‏CT‏µ ، ‏‎16 µm ‎است. با ‏CT‏µ تخلخل داربست هاي با اندازه سوراخ 200 و 500 ميكرومتر به ترتيب %75 و %78 تعيين شده است. مساحت سطح ديواره داربست در واحد حجم هيدروكسي آپاتيت 56 و 81 ‏mm-1‎‏ براي داربست هاي با تخلخل 200 و 500 ميكرومتر مشخص شده است .‏
تصاوير ‏SEM‏ از داربست نشان مي‌دهد، كه داربست با تخلخل‌‏‎200-µm ‎‏ داراي تخلخل هاي با قطر‏‎100-200µm‎‏ و داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ داراي تخلخل هاي با قطر ‏‎300-500µm‎‏ است. ديواره داربست با بلورهاي سوزني شكل در مقياس نانو پوشيده شده است كه احتمالاً هيدروكسي آپاتيت است. ‏

كميت ‏DNA
DNA‏ از داربست استخراج مي شود، چون مقدار ‏DNA‏ متناسب با تعداد سلول ها است. به اين ترتيب مي توان تكثير سلول ها را پيگيري كرد. ( شكل ‏‎5‎‏ ) در روز 1 تعداد سلول بيشتري به داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏  ، ‏‎109%‎‏ ، نسبت به داربست با تخلخل‌‏‎200-µm ‎‏ ، %74‏‎ ‎، چسبيده بود (‏‎ ‎به ازاي هر 106 سلول تقريبا ‏‎µg‎‏ 7 ‏DNA‏ داريم). براي كشت استاتيك در هر دو نوع داربست كاهش سطح ‏DNA‏ يا ثابت ماندن در 14 روز اول ديده مي شود. براي كشت استاتيك ، داربست با تخلخل ‏‎200-µm ‎‏ در روز 21 به نصف روز 1 كاهش يافته است و داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ در روز 21 كمي بيشتر از روز 1 است. در كشت ديناميك ، مقدار ‏DNA‏ براي  داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏  در طول دوره ثابت مي ماند و در روز 21 بيشتر از كشت استاتيك است. به نظر مي‌رسد كه كشت ديناميك در و داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ اثر بيشتري بر تكثير سلول ها دارد، چون مقدار ‏DNA‏ در طول دوره افزايش مي يابد. اين امر با تعداد سلول بيشتر در روز 14 و 21 در هر دو روش كشت نشان داده شده است. در مقايسه داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ ،داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ سطح ‏DNA‏ بالاتري در روز 14 و 21 در هر دو روش كشت دارد. سطح ‏DNA‏ در تمام نقاط زماني براي داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ بدون توجه به روش كشت بالاتر است( براي روز 7 ، 14 و 21 ). ‏

‏ فعاليت ‏ALP
فعاليت ‏ALP‏ يكي از رايج ترين ماركرهاي استئوژنز8‎ ‎‏ است و براي سنجش تمايز سلول هاي استخوان سازي9 بكار مي رود. اين فعاليت بعد از يك مدت زمان مشخص به پيك مي رسد و دوباره كاهش مي يابد. در شكل ‏‎7‎‏ ، فعاليت‌‏ALP ‎‏ ترسيم شده است. در روز اول داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ در مقايسه با ‏‎200-µm‎، فعاليت‌‏ALP ‎‏ بالاتري دارد. براي داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ در كشت استاتيك فعاليت‏ALP ‎‏ بطور يكنواخت از روز 1 تا 21 افزايش يافت. در روش كشت ‏spinner flask‏ در داربست با تخلخل‎200-µm‎‏ ، فعاليت ‏ALP ‎‏ در روز 14 به حداكثر رسيده كه تفاوت فاحشي با كشت استاتيك دارد. در داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ ، فعاليت ‏ALP ‎‏ در روش كشت ‏spinner flask‏ نيز در روز 14 به حداكثر رسيد، ولي تفاوت چنداني با نمونه هاي كشت استاتيك ندارد.به علاوه در مقايسه  داربست ها با تخلخل ‏‎200-µm‎‏  و ‏‎500-µm‎‏ در روزهاي 7 و 14 در كشت ‏spinner flask‏  ، داربست با تخلخل‎200-µm‎‏ ، فعاليت ‏‎ ALP ‎‏ بالاتري دارد. سطح ‏ALP‏ در روزهاي 7 ، 14 و 21 بدون در نظر گرفتن روش كشت براي داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ پايين تر است. ‏

بافت شناسي10
‎ ‎به منظور تعيين چگونگي توزيع سلول ها در داربست ، از قسمت مركزي داربست قسمتي را برش داده و رنگ آميزي كرده و سپس تصاويري توسط ميكروسكوپ فلوئوررسانس تهيه شده است. تصاوير از بخش فوقاني تا تحتاني مقطع مركزي داربست تهيه شد. (شكل ‏‎7‎‏ ) تفاوت آشكاري بين كشت ديناميك و استاتيك در هر دو نوع داربست در روز 21 مشاهده مي شود. همچنين شكل نشان مي دهد كه تعداد سلول بيشتري در داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ در نقاط زماني مورد بررسي وجود دارد. در روز 21 كشت استاتيك داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏  ، لايه نازكي از سلول ها در محيط بيروني داربست و تعداد بسيار كمي سلول در بخش مركزي داربست وجود دارد. به علاوه ، نتايج بافت شناسي مشخص مي كند كه در كشت استاتيك داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ ، تعداد سلول ها از روز اول تا 21 كاهش يافته است. از سوي ديگر ، افزايش تعداد سلول ها در روش كشت ديناميك از روز اول تا 21 در داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ مشاهده مي شود و تعداد زيادي سلول در قسمت مركزي داربست موجود است. با مقايسه شكل هاي ‏‎7D‎‏ و ‏‎7E‎‏ معلوم مي شود كه در كشت استاتيك داربست با تخلخل‎500-µm‎‏ ‏‎ ‎، تعداد سلول ها ثابت مانده است. مانند داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ ، تعداد سلول ها در كشت ديناميك از روز اول تا بيست و يكم افزايش قابل توجهي داشته و تعداد زيادي سلول در بخش مركزي داربست وجود دارد.

 ‏
S ‎EM
جهت بررسي مورفولوژي سلول ، از سطح فوقاني داربست تصاوير ‏SEM‏ تهيه شده است (شكل-‏‎8‎‏ ) . در روز اول تفاوت آشكاري بين داربست هاي با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ و ‏‎500-µm‎‏ وجود دارد. ‏
تعداد سلول بيشتري در داربست با تخلخل ‏‎500-µm‎‏ وجود دارد‌ و شروع به تشكيل سطح سلول ها كرده در حاليكه سلول ها در داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ از هم منفك تر است . در روز 21 از كشت استاتيك ، يك صفحه نازك از سلول ها و ماتريكس داربست هاي با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ و ‏‎500-µm‎‏   پوشانده است . در روز 21 كشت ديناميك ، لايه ضخيمي از سلول و ماتريس خارج سلولي در دو داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ و ‏‎500-µm‎‏ وجود دارد. در شكل هاي ‏‎8G‎‏ و ‏‎8H‎‏ تصاوير ‏close-up‏ چسبندگي سلول ها را به ماتريكس نشان مي دهند. اين شكل ها مشخص مي‌كند كه در هر دو داربست با تخلخل ‏‎200-µm‎‏ و ‏‎500-µm‎‏ در روز اول نقاط كانوني اتصال سلول ها در سطح زبر و خشن بلورهاي هيدروكسي آپاتيت است كه با جزئيات در شكل ‏‎4E‎‏ نشان داده شده بود. ‌اغلب بلورهاي هيدروكسي آپاتيت در درون تخلخل هاي داربست واقع مي شود و تمايلي به قرار گرفتن در مقاطع برش بالا و پايين ندارد. ‏

نتيجه گيري
دو روش كشت و داربست هايي با دو اندازه تخلخل مختلف بررسي شده قابليت ‏‎ ‎تمايز ، تكثير و توزيع سلول ها را در واحد حجم داربست آنها بررسي و مقايسه شد. طبق نتايج به دست آمده كه داربست هاي با تخلخل ‏m ‎‏µ 200 داراي نرخ سرعت‏‎ ‎تمايز سلول هاي استخوان زاي بالاتري نسبت به داربست‌هاي با تخلخل ‏m ‎‏µ 500 است و از طرفي در داربست هاي با تخلخل ‏m ‎‏µ 500 سرعت رشد سلول ها بيشتر و تعداد سلول بيشتري نيز در داربست وجود دارد. بنابراين ميكرو تخلخل هاي يك داربست ‏‎3D‎‏ بيومتريال مي تواند براي كنترل سلول هاي مزانشيمي انسان به منظور خاص بكار رود. همچنين مشخص شدكه روش كشت ديناميك ‏spinner flasks‏ باعث افزايش تكثير ، تمايز و ‏‎ ‎توزيع و پخش سلول ها در داربست مي‌شود. پس كشت ديناميك ‏spinner flasks‏ يك سيستم ساده براي استفاده و هزينه معقول براي كشت سلول هاي مزانشيمي انسان روي داربست هاي ‏‎3D‎‏ در اندازه‌هاي كوچك تا متوسط است.  مطالعاتي در محيط ‏vivo‏ لازم است، تا مشخص شود كدام ‏MSC/scaffolds‏ براي كاربردهاي كلينيكي مناسب است. ‏

1 Hydroxyapatite‏ ‏‎ (HA)‎
2 Biocompability
3 Pelvic
4 Donor site
5 Osteogen
6 Alkaline phosphatase
7 Osteoblasts
8 Osteogenesis‎
9 Osteogenic‎
10 Histology

 

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *